前言
逆转录病毒载体因其免疫原性低，基因整合稳定及目的细胞广泛的优点，广泛应用于细胞基因治疗。截至日前，被FDA批准上市的6个CAR-T细胞药物均采用了慢病毒/逆转录病毒来进行CAR转基因递送的。但由于慢病毒/逆转录病毒具有半随机整合的特性，可能会带来一定的基因突变风险，比如通过激活整合位点附近的原癌基因，进而提高肿瘤发生的风险。
| 整合位点分析的法规要求
美国FDA发布的《Long Term Follow-Up（LTFU）After Administration of Human Gene Therapy Product》提到，“在不止一项临床试验中有报道白血病，其中受试者接受了使用γ逆转录病毒制造的基因修饰过的细胞药物。整合位点分析（Integration Site Analysis，ISA）会对可能的白血病发生机制提供一些线索”。《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》，指出“对包括整合载体的产品推荐进行长期随访，因为整合载体可能会增加延迟不良事件的风险”。EMA1同样推荐在治疗过程中或者长期随访中，分析整合位点。
国家药监局2022年5月发布的《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》明确指出，“基因插入位点和拷贝数：由于其关系到产品的安全性和有效性，需采用适用的检测方法进行研究，探索其与安全性和疗效的相关性”。《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》指出，“分析载体在基因组中的整合方式和整合位点的分布趋势，评估其插入导致细胞发生基因突变、基因失活/激活，或细胞癌变的风险”。《体外基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》也建议，“关注病毒载体稳定性的变化、整合位点的偏好”。
| 整合位点分析的服务
为了满足逆转录病毒载体在细胞治疗产品申报及长期临床随访中的安全性研究需求，禾沐基因推出了一项专业的病毒插入位点分析（ISA）服务。这项服务能够对细胞治疗产品、临床前研究以及临床研究中的骨髓和外周血样本进行高度灵敏和精确的整合位点检测，以及克隆占比的定量分析。我们依据中国药品审评中心（CDE）的申报指南和权威文献，对样本中的整合位点进行全面的安全性评估，并提供深入的结果解读，形成分析方法学报告和结果分析报告，以支持产品的IND申报和长期安全性的监测。
| 技术路线
禾沐基因所开发的的病毒载体整合位点分析服务采用基于LM-PCR技术的高通量测序技术。LM-PCR（Ligation-mediated PCR）是目前较为成熟的逆转录病毒载体整合位点的分析方法，广泛应用于已上市的CAR-T产品的安全性评估。
LM-PCR方法中，随机打断的DNA在接上特异性接头后使用针对病毒载体固定序列的引物进行定向扩增，以实现目的序列的富集。但此过程的PCR可能伴随一定的偏好性，影响整合位点的精确定量，因此，禾沐基因在特异性接头上引入了一段随机UMI序列，作为每个整合位点的身份识别码，可实现对整合位点的精准定量。具体技术路线如图1所示：
图1 LM-PCR方法的原理
| 方法性能
基于中国药典内分析方法指导原则要求，禾沐基因对本方法开展了全面的方法学验证，包括专属性，检测下限，准确性，线性，定量限，耐用性，重复性及中间精密度验证。如图2所示，本方法可以准确检出占比低至0.1%的阳性细胞系中所有5个病毒载体整合位点。
·准确鉴定低至0.1%的细胞克隆中的整合位点
图2 LM-PCR方法的高灵敏度
此外，本方法可以实现对占比5%以上的阳性细胞系的准确定量，因此可以实现对样本中优势克隆的准确鉴定。如下图所示，本方法在阳性细胞系占比在0.05%-75%之间线性良好（R2=0.99）,且对占比在5%-75%之间可进行准确定量。
·准确定量5%及以上的细胞克隆
| 示例结果
基于鉴定得到的整合位点，可实现对全基因组的整合特征评估及整合突变风险评估，结合权威参考文献及CDE指导意见，对评估结果进行详细解读以全面评估病毒载体的潜在风险。具体包含的分析项目如下表所示：
通过整合位点上下游序列一致性分析，在全基因组及不同基因区（不同GC%及基因组重复序列）中的分布情况统计对比，评估整合特征与权威文献中的一致性，是否符合逆转录病毒载体整合的保守特征。通过整合位点相较于CpG岛及TSS的分布特征分析，评估潜在的影响邻近基因表达的风险。通过对整合位点克隆占比的统计及多样性分析，评估是否存在优势克隆。通过整合热点（CIS）分析及基于整合位点的GO富集分析，评估潜在的基因突变风险。此外还特别关注癌症相关基因的整合频率，评估潜在致癌风险。部分示例分析结果如下所示：
图4 整合位点在人基因组的分布与基因分布的对比
图4中平行展示了样本三次重复检测中 IS 在整个人基因组中的分布（蓝色条形图）及基因在人基因组中的分布（红色条形图），条形图的上方标注了染色体编号。本样本的三次平行检测出的 IS 的分布高度一致，且均呈现出在基因富集区更高的整合频率，这可能是由于基因编码区由于基因的表达所以染色质的开放性更高所导致的。
常见整合位点（CIS）分析是鉴定样本中偏好性整合位点的重要手段。基于距离 IS 最近的基因对基因组分区，采用基于全基因组 Grubbs 检验的方法可鉴定整合频率显著高于背景值的热点整合区域。例如，下图样本的三次重复中未鉴定出统计意义上显著（FDR-corrected p-value < 0.05）的常见整合位点（CIS），表明样本中未检出显著的偏好性整合。下图还展示了样本中所有的 CIS，字体大小代表该基因附近 IS 的整合频率。如图5所示，样本中整合频率最高的 CIS 为 PACS1 及 GPATCH8，与文献中报道的基因治疗中慢病毒载体整合热点相近。而文献报道的与克隆扩增相关的整合热点，如 VAMP4，PRDM16，CCND2 和 HMGA2 在本样品中均未检出或整合频率低。因此 CIS 分析未发现偏好性整合或潜在克隆扩增风险。
图5 常见整合位点（CIS）分析结果
为了评估潜在致癌风险，还可对样本中位于癌症相关基因内的整合位点进行分析，如图6所示。癌症相关基因列表获取自 UniProt 数据库，包括 560 个抑癌基因（TSGs）及 17 个原癌基因。
图6 癌症相关基因的整合频率
禾沐基因开发的病毒插入位点分析（ISA）平台另已在谱新生物服务平台上线，基于LM-PCR技术深入分析逆转录病毒载体整合位点，确保细胞治疗产品安全性，支持产品临床申报与临床研究及上市产品的长期随访。
参考资料
1. GUIDELINE ON FOLLOW-UP OF PATIENTS ADMINISTERED WITH GENE THERAPY MEDICINAL PRODUCTS，EMA
